Validasi Metode Analisa (VMA)

VMA1

Tujuan dari pelaksanaan Validasi Metode Analisa (VMA) adalah untuk menunjukkan bahwa semua metode tetap yang digunakan sesuai dengan tujuan penggunaannya dan selalu memberikan hasil yang dapat dipercaya.  Jadi, dalam Validasi metode analisa yang diuji atau divalidasi adalah PROTAP (prosedur tetap) pengujian yang bersangkutan. Misalnya, “Validasi Metode Analisa Penetapan Kadar Zat Aktif Paracemol dalam Tablet Biogesic® dengan Metode Spektrofotometri UV/Vis”, maka yang divalidasi atau diuji validitasnya adalah Prosedur Tetap “Penetapan Kadar Zat Aktif Paracemol dalam Tablet Biogesic® dengan Metode Spektrofotometri UV/Vis”.

PROTAP tersebut bisa disusun oleh Bagian QC atau oleh Bagian R&D. Apabila PROTAP-nya belum tersedia maka harus dibuat terlebih dahulu, baru divalidasi. PROTAP metode analisa tersebut, bisa jadi disusun berdasarkan :

  1. Diambil (di-adopsi) dari berbagai literatur resmi, misalnya Farmakope Indonesia (FI), Unite State Pharmacopea (USP), British Pharmacopea (BP) dan lain-lain (kompendial)
  2. Berasal dari pengembangan sendiri (Eksporasi)
  3. Modifikasi dari prosedur pengujian yang telah ada (Modifikasi).

 

 Ruang Lingkup

  • Validasi Metode Analisa dilakukan untuk SEMUA metoda analisa yang digunakan untuk pengawasan kegiatan produksi, termasuk metode analisis yang digunakan dalam menetapkan residu zat aktif pada validasi prosedur pembersihan.
  • Validasi metode analisa umumnya dilakukan terhadap 4 jenis, yaitu :
    1. uji identifikasi;
    2. uji kuantitatif kandungan impuritas (impurity);
    3. uji batas impuritas; dan
    4. uji kuantitatif zat aktif dalam sampel bahan aktif obat atau obat atau komponen tertentu dalam obat.

Note : Metode analisis lain, seperti uji disolusi untuk obat atau penentuan ukuran partikel untuk bahan aktif obat, hendaklah juga divalidasi

  • Dilakukan dengan semua peralatan yang telah dikalibrasi dan diuji kesesuaian sistemnya (alat dan sistem sudah dikualifikasi).
  • Menggunakan bahan baku pembanding yang sudah dibakukan dan disimpan ditempat yang sesuai.

 

 Parameter Uji

Dalam bahasa yang sederhana, dalam VMA ini kita akan MENGUJI cara-cara PEMERIKSAAN atau PENGUJIAN yang kita lakukan (misalnya identifikasi, penetapan kadar zat aktif, menguji sisa/residu, dan sebagainya) agar kita YAKIN bahwa PENGUJIAN yang kita lakukan tersebut SUDAH BENAR dan HASIL PENGUJIAN yang dilakukan benar-benar TERPERCAYA. Untuk melakukan PENGUJIAN tersebut, kita menggunakan apa yang disebut dengan PARAMETER UJI. Parameter uji ini meliputi, antara lain :

  • akurasi (Accuracy);
  • presisi (precision);
    • ripitabilitas (repeatibilty);
    • Presisi antara (intermediate precision);
    • reprodusibilitas/keterulangan (reproducibility)
  • spesivisitas (specify)/Selektifitas (selectivity);
  • batas deteksi (limit of detection/LOD);
  • batas kuantitasi (limit of quantitation/LOQ);
  • linearitas (Linearity); dan
  • rentang (range).

Penentuan Parameter uji yang dilakukan, sangat tergantung dari jenis Pengujian yang dilakukan serta sumber dari prosedur pengujian tersebut. Lihat tabel berikut :

 Tabel Parameter ujiTabel Parameter uji1

Tabel Parameter uji2

Pengertian Parameter Uji

Spesifitas/Selektifitas

  • Merupakan kemampuan suatu metode analisa untuk membedakan senyawa yang diuji dengan derivat/metabolitnya.
  • Adanya perbedaan nyata antara resolusi antara dua puncak yang berdampingan dan kemurnian tiap puncak dalam kromatogram.
  • Untuk HPLC, Rs : 1,2 – 1,5.
  • Untuk Spektrofotometer UV/Vis: jarak dua puncak berdampingan: resolution factor   (Rf) > 2,5.
  • Lakukan scanning (pemindaian) sampel yang diuji lihat kromatogram dari dua puncak yang berdekatan (Rs) harus tidak kurang dari 1,5 atau terlihat adanya puncak yang terpisah dari scanning dengan spektrofotometer UV/Vis.
  • Pemisahan dua puncak yang berdekatan dalam kromatogram, resolusi (R) ditentukan dengan persamaan :

selectivitas

Di mana t2 dan t1 adalah waktu retensi dua komponen, W1 dan W2 adalah lebar puncak. Komponen pertama dan komponen kedua yang diukur dengan jalan ekstrapolasi sisi puncak yang relatif lurus sampai garis dasar (base line).

Resolusi harus lebih besar dari 1,5.

 

Hasil Kromatogram Uji Selektifitas/Spesifitas yang memenuhi persyaratan

Hasil Kromatogram Uji Selektifitas/Spesifitas yang memenuhi persyaratan

 

Hasil Kromatogram uji selektifitas yang tidak memenuhi persyaratan

Hasil Kromatogram uji selektifitas yang tidak memenuhi persyaratan

 

Linearitas

  • Merupakan kemampuan suatu metode analisa untuk menunjukkan hubungan secara langsung atau proporsional antara respons detektor dengan perubahan konsentrasi analit
  • Diuji secara statistik, yaitu Linear Regression (y = a + bx); dimana b adalah kemiringan slope garis regresi dan a adalah perpotongan dengan sumbu y.

                                                ∑ (x – Xbar)(y- Ybar)

Koefisien korelasi (r) = ——————————–

√[ ∑ (x –Xbar)∑ (y- Ybar)]

x adalah pengukuran individual dalm N pengukuran x (bar) adalah nilai rata-rata pengukuran; y adalah nilai individual sebenarnya dalam N nilai sebenarnya dan y (bar) adalah nilai rata-rata sebenarnya.

  • Pengujian dilakukan paling tidak dengan menggunakan 5 kadar yang berbeda, kemudian dilihat apakah memberikan respons yang linear apa tidak, yang ditunjukkan dengan nilai r ≥ 0,98.
Pegujian Linearitas

Pegujian Linearitas

 

Akurasi (ketepatan)

  • Merupakan kemampuan suatu metode analisa untuk memperoleh nilai yang sebenarnya (ketepatan pengukuran).
  • Terdapat 5 metode penentuan akurasi untuk penetapan kadar bahan aktif obat dalam bahan baku dan produk obat, yaitu :
    1. Menggunakan metode analisis untuk menetapkan kadar analit dalam bahan baku berkhasiat yang diketahui kemurniannya (misalnya bahan baku pembanding sekunder).
    2. Bahan baku berkhasiat atau cemaran dalam jumlah yang diketahui ditambahkan kedalam plasebo. Metode analisis ini akan digunakan untuk penetapan kadar bahan baku berkhasiat/cemaran dalam produk obat.
    3. Bila plasebo tidak bisa diperoleh, verifikasi akurasi metode dapat dilakukan dengan teknik standar adisi, yaitu dengan menambahkan sejumlah tertentu analit kedalam produk obat yang telah diketahui kadarnya. Metode analisis ini digunakan untuk penetapan kadar bahan baku berkhasiat/cemaran dalam produk obat
    4. Menambahkan cemaran dalam jumlah tertentu ke dalam bahan baku berkhasiat/produk obat. Metode analisis ini digunakan untuk penetapan kadar cemaran dalam bahan baku berkhasiat dan produk obat
    5. Membandingkan dua metode analisis untuk mengetahui ekivalensinya, yaitu membandingkan hasil yang diperoleh dari metode analisis yang divalidasi terhadap hasil yang diperoleh dari metode analisis yang valid (akurasi metode analisis yang valid ini telah diketahui). Metode analisis ini digunakan untuk penetapan kadar bahan baku berkhasiat dalam bahan baku berkhasiat, produk obat dan penetapan kadar cemaran.
  • Akurasi dinyatakan sebagai prosentase (%) perolehan kembali (recovery).
  • Akurasi dinilai dengan menggunakan sedikitnya 9 penentuan dengan sedikitnya 3 tingkat konsentrasi dalam rentang pengujian metode analisis tersebut (misalnya 3 konsentrasi/3 replikasi untuk tiap prosedur analisis lengkap).
  • Ketepatan metode analisa dihitung dari besarnya rata-rata (mean, x) kadar yang diperoleh dari serangkaian pengukuran dibandingkan dengan kadar sebenarnya.

 

Hasil analisis

Recovery =   —————–       x 100%

Nilai sebenarnya

 

Syarat recovery : 98 – 102 %

 

Presisi (Ketelitian)

  • Merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk menunjukkan kedekatan dari suatu seri pengukuran yang diperoleh dari sampel yang homogen.
  • Terdapat 3 kategori pengujian presisi, yaitu :
    1. Keterulangan (repeatability), dinilai dengan menggunakan minimum 9 penentuan dalam rentang penggunaan metode analisis tersebut (misalnya 3 konsentrasi/3 replikasi).
    2. Presisi Antara, yaitu perbedaan antar operator/analis dengan sumber reagensia dan hari yang berbeda.
    3. Reprodusibilitas, dengan menggunakan beberapa laboratorium untuk validasi metode analisis, agar diketahui pengaruh lingkungan yang berbeda terhadap kinerja metode analisis.
Macam-macam Presisi

Macam-macam Presisi

  • Presisi dinyatakan dalam bentuk RSD (relative standart deviation) atau SRB (sebaran baku relatif) .
  • Persyaratan RSD sebagai berikut :

Presisi

 

Batas Deteksi (Limit of Detection/LOD)

  • Merupakan jumlah analit terkecil yang masih bisa dideteksi namun tidak perlu dapat terukur.
  • Beberapa pendekatan yang dapat digunakan untuk menentukan batas deteksi tergantung pada jenis metode analisis apakah metode analisis instrumental atau noninstrumental.
    1. Berdasarkan evaluasi visual
      Evaluasi visual dapat digunakan untuk metode analisis noninstrumental,  tapi dapat juga digunakan untuk metode analisis instrumental. Batas deteksi ditentukan dengan melakukan analisis terhadap sampel yang diketahui konsentrasinya dan menetapkan
      kadar terendah yang dapat dideteksi dengan baik.
    2. Berdasarkan rasio signal terhadap noise
      Pendekatan ini hanya dapat diterapkan pada metode analisis yang memberikan baseline noise. Penentuan signal to noise dilakukan dengan membandingkan pengukuran signal sampel yang diketahui mengandung analit dalam konsentrasi rendah dan blanko, kemudian dapat ditetapkan konsentrasi minimum analit yang dapat dideteksi dengan baik. Rasio signal to noise sama dengan 3 atau 2 : 1 umumnya dianggap dapat diterima untuk memperkirakan batas deteksi.
  • Simpangan respon dan kemiringan (“slope”) kurva kalibrasi :
    Batas deteksi dapat dinyatakan sebagai :

    LOD

    LOD

Batas Kuantitasi (Limit of Quantitation/LOQ)

  • Merupakan jumlah analit terkecil yang yang masih bisa diukur dengan akurat (tepat) dan presisi (teliti)/reprodusible.
  • Beberapa pendekatan yang dapat digunakan untuk penentuan batas kuantitasi
    tergantung pada jenis metode analisis instrumental atau noninstrumental.

    1. Berdasarkan evaluasi visual
      Evaluasi visual dapat digunakan untuk metode analisis noninstrumental, tapi dapat juga digunakan untuk metode analisis instrumental. Batas kuantitasi ditentukan dengan melakukan analisis terhadap sampel yang diketahui konsentrasinya dan  menetapkan kadar terendah analit yang dapat ditentukan secara kuantitatif dengan akurasi dan presisi yang dapat diterima
    2. Berdasarkan rasio signal terhadap noise :
      Pendekatan ini hanya dapat digunakan pada metode analisis yang memberikan baseline noise. Penentuan rasio signal terhadap noise dilakukan dengan membandingkan signal yang diukur dari sampel yang mempunyai konsentrasi analit yang rendah dan blankonya, kemudian ditentukan konsentrasi terendah analit yang dapat ditetapkan secara kuantitatif dengan baik, umumnya pada rasio signal terhadap noise 10:1.
    3. Simpangan baku dari respon dan kemiringan (slope) kurva kalibrasi :
      Batas kuantitasi dapat dinyatakan sebagai :
LOQ

LOQ

Ketegaran (robustness)

  • Merupakan kapasitas suatu metode analisis untuk TIDAK terpengaruh oleh variasi-variasi kecil dalam parameter metode analisa.
  • Contoh variasi kecil dalam metode analisa secara HPLC, antara lain: pH fase gerak, suhu, tekanan, stabilitas, jumlah pelarut organik yang dimodifikasi, konsentrasi buffer, konsentrasi additive, flow rate, suhu kolom, dan lain-lain.

 Kriteria Penerimaan

Metode Analisa dinyatakan memenuhi syarat (valid), jika :

  • Seluruh parameter uji (Spesifitas/selektifitas, Linearitas, Akurasi, Presisi, LOD, LOQ dan Robustness) memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.
  • Tidak ada perbedaan bermakna antar analis atau antar dosis yang diuji atau antar lab. (t uji < t tabel).

 

Validasi Ulang

Validasi ulang mungkin diperlukan pada kondisi sebagai berikut:

  • perubahan sintesis bahan aktif obat;
  • perubahan komposisi produk jadi; dan
  • perubahan prosedur analisis.

Tingkat validasi ulang yang diperlukan tergantung pada sifat perubahan. Perubahan tertentu lain mungkin juga memerlukan validasi ulang.

Demikian, mudah-mudahan bermanfaat.

Salam hangat,

BP – 22.09.2014

Iklan

8 thoughts on “Validasi Metode Analisa (VMA)

  1. itung23

    Saya melihat di POPP halaman 626 untuk verifikasi penetapan kadar yg telah sesuai dgn kompendial, ditulis bahwa untuk parameter presisi menggunakan 7 sampel –> 7 kadar, apakah dalam analisa rutinnya nanti harus tetap menggunakan 7 sampel juga sesuai dengan laporan verifikasi?
    *dalam kasus ini protap penetapan kadar baru develop,jadi dilakukan percobaan verifikasi dulu

    Balas
  2. Ping balik: Validasi Metode Analisis (3) | Bisa Kimia

  3. Tati Herawati

    Mau tanya Pak
    Kalau suatu metoda analisa dengan HPLC sudah divalidasi, apabilan ada alat HPLC yang baru, apakah metoda analisa tersebut harus divalidasi ulang menggunakan HPLC yang baru?
    Apakah mencakup semua parameter uji?
    Terima kasih pak.

    Balas
  4. Tati

    Mau tanya pa.
    Metoda analisa menggunakan HPLC sudah divalidasi, apabila ada alat HPLC yang baru, apakah harus dilakukan validasi ulang menggunakan alat HPLC yang baru.
    Apakah mencakup semua parameter validasi?
    Terima kasih Pa bambang.

    Balas

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout /  Ubah )

Foto Google

You are commenting using your Google account. Logout /  Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout /  Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout /  Ubah )

Connecting to %s